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高效液相色譜法測(cè)定血紅蛋白氧載體中殘留的戊二醛
摘要:戊二醛, 分子式為C5H8O2,帶有刺激性氣味的無(wú)色透明油狀液體,溶于熱水。用作殺菌劑,也用于皮革鞣制。對(duì)眼睛、皮膚和粘膜有強(qiáng)烈的刺激作用。
建立了一種測(cè)定血紅蛋白氧載體中戊二醛殘余含量的高效液相色譜方法。用10kDa超濾膜通過(guò)離心3000r/min×20min將游離戊二醛從待測(cè)樣品中分離;在pH1.0時(shí),在含有70%乙腈的體系中用2,4?二硝基苯肼在30min內(nèi)將戊二醛衍生成2,4?二硝基苯腙(n(2,4?二硝基苯肼)∶n(戊二醛)=60∶1),以70%乙腈為流動(dòng)相,避免了衍生產(chǎn)物生成沉淀。用高效液相色譜法分離測(cè)定衍生物,可在20min內(nèi)完成分離,同時(shí)對(duì)衍生步驟進(jìn)行了優(yōu)化。本方法具有較高的靈敏度和良好的線性關(guān)系,檢出限為1.0ng,在0.1~10mg/L范圍內(nèi)其線性相關(guān)系數(shù)為0.9999,重復(fù)測(cè)定6次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%,回收率為95.26%。
【關(guān)鍵詞】戊二醛,高效液相色譜,血紅蛋白氧載體,2,4?二硝基苯肼
1引言
血紅蛋白氧載體(Hemoglobin?basedoxygencarriers,HBOCs)是血液替代品中熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一[1,2]。其常用的一種制備方法是以多醛基分子為交聯(lián)劑,如戊二醛,開(kāi)環(huán)棉籽糖等將血紅蛋白交聯(lián)制備而成[3,4]。游離的戊二醛有一定的毒性,在臨床使用前必須除去。
檢測(cè)醛類(lèi)氣相色譜[5~7]具有較高的分析速度,但是靈敏度相對(duì)較低[8]。高效液相色譜被廣泛應(yīng)用于醛的測(cè)定[9~11],在測(cè)定戊二醛時(shí),顯示出更高的靈敏度[8]。
在液相色譜法中,2,4?二硝基苯肼(2,4?dinitrophenylhydrazine,DNPH)柱前衍生法是測(cè)定醛基的強(qiáng)有力的工具之一。文獻(xiàn)報(bào)道大多是測(cè)定空氣中戊二醛的污染,未見(jiàn)測(cè)定血紅蛋白氧載體中戊二醛的報(bào)道?!吨袊?guó)生物制品規(guī)程》中測(cè)定無(wú)細(xì)胞百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗中戊二醛的方法[12]不能直接用于血紅蛋白氧載體中戊二醛的測(cè)定,需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)處理,且線性關(guān)系較差。因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定血紅蛋白氧載體中殘留戊二醛的方法進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
2實(shí)驗(yàn)部分
2.1儀器與試劑
高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司),包括SCL?10Avp控制器,SPD?10Avp檢測(cè)器,LC?10Atvp雙泵,DGU?10A脫氣系統(tǒng),CTO?10Asvp柱溫箱,Class?vp工作站;CBN8?30恒溫水浴(丹麥Heto公司)。5804R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司),10kDa超濾膜(美國(guó)Millipore公司),SigoTCI?Ⅱ恒流泵(北京思路高公司),KL?UP?Ⅱ20超純水機(jī)(臺(tái)灣艾柯公司)。2,4?二硝基苯肼(98%)、HClO4、25%戊二醛(w/w)購(gòu)自Sigma公司,乙腈(色譜純,F(xiàn)isher公司)。
2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱(chēng)取2.3760gDNPH,用20%HClO4溶解并定容至100mL,配制成濃度為120mmol/L的貯備液,用20%HClO4稀釋至30mmol/L作為工作液。
2.2.2無(wú)基質(zhì)血紅蛋白(Stroma?freehemoglobin,SFH)的制備SFH的制備程序參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]的方法。
2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線將戊二醛分別稀釋成0.1,0.5,1,2,4,6,8和10mg/L,分別取0.5mL于5mL離心管中,加入1.4mL乙腈,再加入0.1mL120mmol/LDNPH,立即于混旋器上混合均勻,反應(yīng)30min后,用有機(jī)濾膜過(guò)濾后,上樣20μL進(jìn)行分析。
2.2.4血紅蛋白的聚合過(guò)程中戊二醛的測(cè)定血紅蛋白的聚合參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行,取80g/LSFH50mL,用恒流泵逐滴加入適量的戊二醛(n(SFH)∶n(戊二醛)=1∶10),待滴加完畢,聚合反應(yīng)4h后,加入1.0mol/L甘氨酸(終濃度0.1mmol/L)進(jìn)行終止,1h后,加入還原劑二甲胺基硼烷(DMAB)進(jìn)行還原(n(戊二醛)∶n(DMAB)=1∶6),反應(yīng)1h后,用Ringer′s液作為透析液透析24h,每6h換液一次,共換液4次。4℃保存15d,各取5.0mL加入到2個(gè)超濾膜(10kDa,Millipore)中[15],在4℃以3000r/min離心20min,取下層液體0.5mL,按2.2.3步驟進(jìn)行衍生并測(cè)定。
2.3色譜條件
Shim?packVP?ODS色譜柱(250mm×4.6mmi.d.,5μm,孔徑12nm,日本Shimadzu公司);流動(dòng)相:70%乙腈,流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):360nm。
3結(jié)果與討論
3.1目標(biāo)產(chǎn)物的確定
戊二醛有2個(gè)醛基,與DNPH反應(yīng)后生成的DNPH?one有3種可能的異構(gòu)體:順?順、順?反、反?反異構(gòu)體。圖1為標(biāo)準(zhǔn)戊二醛衍生后的色譜圖。圖1在乙腈體系中衍生的2,4?二硝基苯腙的色譜圖
Fig.1Chromatogramof2,4?dinitrophenylhydrazine(DNPH)?ones.Themobilephaseis70%acetonitrile
峰(peak)1.過(guò)量的DNPH(ExcessDNPHreagent);峰(peak)2,3.DNPH?ones異構(gòu)體(DNPH?oneisomer).有2個(gè)明顯的目標(biāo)峰(峰2與3),應(yīng)該為DNPH?one的其中兩種異構(gòu)體,具體為哪一種異構(gòu)體還有待于進(jìn)一步鑒定,第3種異構(gòu)體沒(méi)有觀測(cè)到的原因可能是由于異構(gòu)體之間結(jié)構(gòu)非常相似,第3種異構(gòu)體保留時(shí)間和另外兩種異構(gòu)體的其中一種相同,也可能是第3種異構(gòu)體的含量特別少,很難觀測(cè)到。在一定范圍內(nèi)用不同濃度的反應(yīng)物進(jìn)行分析,該峰2和峰3的峰面積都和戊二醛濃度之間有良好的線性關(guān)系,都可用于定量研究。分析化學(xué)第37卷第10期嚴(yán)坤平等:高效液相色譜法測(cè)定血紅蛋白氧載體中殘留的戊二醛
3.2色譜條件的優(yōu)化
在酸性情況下,用過(guò)量的DNPH充分和醛基反應(yīng),此反應(yīng)的產(chǎn)物2,4?二硝基苯腙在水中的溶解度較小,而在乙腈中的溶解度較大,圖2在50%乙腈體系中進(jìn)行衍生的2,4?二硝基苯腙樣品過(guò)濾前(a)后(b)色譜圖對(duì)比
色譜條件和圖1相同(OtherconditionsarethesameasdescribedinFig.1).峰(peak)1.過(guò)量的DNPH(ExcessDNPHreagent);峰(peak)2,3.DNPH?ones異構(gòu)體(DNPH?oneisomer)。直接在水中反應(yīng)或在乙腈比例較小時(shí)會(huì)使生成的產(chǎn)物產(chǎn)生沉淀。將6.0mg/L戊二醛在50%乙腈水溶液中衍生,產(chǎn)物用70%乙腈進(jìn)行分離,如圖2a所示,可以看出2,4?二硝基苯腙的色譜峰有明顯的拖尾,而將產(chǎn)物過(guò)濾后上樣(圖2b),則色譜峰無(wú)拖尾現(xiàn)象,這說(shuō)明拖尾是由于沉淀在吸附在色譜柱上,隨流動(dòng)相中重新溶解后再被洗脫下來(lái)的緣故。而若將6.0mg/L戊二醛在70%乙腈水溶液中衍生,產(chǎn)物仍用70%乙腈進(jìn)行分離,結(jié)果發(fā)現(xiàn),產(chǎn)物過(guò)濾和不過(guò)濾譜圖結(jié)果完全相同,都無(wú)拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)證實(shí),戊二醛濃度達(dá)到10.0mg/L時(shí),在70%乙腈水溶液中衍生不會(huì)產(chǎn)生沉淀。本實(shí)驗(yàn)室采用文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定血紅蛋白氧載體中的戊二醛時(shí),發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系較差,這就是由于采用的乙腈濃度太低,在衍生較高濃度的戊二醛(>6.0mg/L)時(shí)就會(huì)有沉淀產(chǎn)生,沉淀被過(guò)濾后導(dǎo)致定量分析不準(zhǔn)確。因此,衍生反應(yīng)應(yīng)該在乙腈比例較高的溶液中進(jìn)行,而且盡可能和流動(dòng)相比較接近,在70%乙腈溶液中進(jìn)行衍生可滿足10.0mg/L以下戊二醛的衍生。流動(dòng)相中乙腈的比例越大,衍生物洗脫時(shí)間就越短,峰形更為尖銳,相應(yīng)的靈敏度也越高,但是,洗脫時(shí)間太短,過(guò)量DNPH及雜質(zhì)的洗脫峰會(huì)干擾衍生物的洗脫峰,綜合考慮,以70%乙腈溶液為流動(dòng)相較好。
3.3衍生條件的優(yōu)化
在優(yōu)化衍生條件的實(shí)驗(yàn)中,全部采用1.0mg/L戊二醛為分析物濃度,峰面積以最靈敏的峰3計(jì)算。
3.3.1DNPH和戊二醛的摩爾比DNPH和戊二醛反應(yīng)生成希夫堿,該反應(yīng)不能進(jìn)行完全,因此通常采用過(guò)量的DNPH對(duì)戊二醛進(jìn)行衍生,盡可能將戊二醛定量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的腙。本實(shí)驗(yàn)在n(DNPH)∶n(戊二醛)為2∶1~120∶1的范圍內(nèi)研究了戊二醛的衍生反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明,在70%乙腈,pH=1.0,在20℃反應(yīng)30min的條件下,隨著DNPH濃度的增大,衍生物的轉(zhuǎn)化率也逐漸增大,當(dāng)n(DNPH)∶n(戊二醛)≥60∶1時(shí),轉(zhuǎn)化率基本保持不變,此條件可以作為定量分析的條件。本實(shí)驗(yàn)采用n(DNPH)∶n(戊二醛)=60∶1進(jìn)行衍生。
3.3.2pH值在乙腈中,HClO4比HCl的溶解性更好[16],因此,本實(shí)驗(yàn)采用HClO4調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的酸度。為了操作和計(jì)算方便,近似認(rèn)為[H ]≈[HClO4]。本實(shí)驗(yàn)在上述條件下改變pH值,研究了pH值對(duì)衍生反應(yīng)的影響。如圖3所示,pH1.0時(shí),戊二醛的衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高。
圖3pH對(duì)衍生效率的影響
Fig.3EffectsofpHofmediumonconversionefficiencyofglutaraldehydetoitsDNPH?onesn(DNPH)∶n(戊二醛,glutaraldehyde)=60∶13.2.3反應(yīng)溫度分別在0,10,20和30℃的條件下研究了溫度對(duì)衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化效率的影響,結(jié)果各溫度下衍生物的峰面積分別為166702,184363,187247,180590,除在0℃下面積略小外,其余溫度下的面積均非常接近,說(shuō)明在10~30℃的范圍內(nèi)反應(yīng)基本不受溫度影響。因此,本實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。
3.2.4反應(yīng)時(shí)間在80min內(nèi)研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化效率逐漸增大,在反應(yīng)20min后,衍生反應(yīng)達(dá)到平衡,衍生產(chǎn)物的濃度基本保持不變。為保證本方法的耐用性,衍生時(shí)間選擇30min。
3.3工作曲線、檢測(cè)限和精密度
戊二醛濃度在0.1~10mg/L范圍內(nèi)與單峰面積呈線性關(guān)系,其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=109306x-7405.1,相關(guān)系數(shù)(r)為0.9999,而如果采用文獻(xiàn)[12]的方法,r<0.99。逐級(jí)稀釋樣品,進(jìn)樣20μL,當(dāng)信噪比為3時(shí),戊二醛所對(duì)應(yīng)的濃度為0.05mg/L,即檢出限為1.0ng。以1.0mg/L戊二醛進(jìn)行衍生,平行6份,每份樣品各測(cè)定一次,每次進(jìn)樣20μL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.0%。
3.4標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率
采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定回收率。各取終產(chǎn)品5.0mL,分別加入到兩個(gè)10kDa的超濾膜中,在4℃以3000r/min離心10min,合并下層超濾液后取0.5mL,加入0.5μg(10μL0.05g/L)戊二醛,平行5份,按照2.2.3節(jié)進(jìn)行衍生。另取0.5mL超濾液按照2.2.3節(jié)直接進(jìn)行衍生,平行5份作為空白對(duì)照,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入實(shí)驗(yàn),計(jì)算得平均回收率為95.3%。
戊二醛作為交聯(lián)劑直接加入終產(chǎn)品中再次會(huì)引起聚合反應(yīng),所以上述測(cè)定回收率的方法是在超濾液中加入戊二醛進(jìn)行測(cè)定,為考慮超濾膜是否對(duì)戊二醛產(chǎn)生吸附,進(jìn)行了下述兩個(gè)實(shí)驗(yàn),取0.10mg/L戊二醛,(1)同樣品處理方法進(jìn)行處理,然后進(jìn)行色譜分析;(2)直接進(jìn)行衍生后進(jìn)行色譜分析;兩個(gè)實(shí)驗(yàn)各平行10份,對(duì)兩者峰面積平均值在顯著性水平為0.05的情況下進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),結(jié)果兩者無(wú)顯著性差異,說(shuō)明超濾膜對(duì)戊二醛基本無(wú)吸附,不會(huì)對(duì)回收率造成影響。
3.5終產(chǎn)品中戊二醛的測(cè)定
戊二醛和血紅蛋白的胺基反應(yīng)后生成希夫堿結(jié)構(gòu),希夫堿經(jīng)過(guò)還原后,生成穩(wěn)定的CN單鍵,但是,希夫堿是否能被100%還原還不清楚,如果沒(méi)有完全還原,由于生成希夫堿是可逆反應(yīng),在一段時(shí)間后,沒(méi)有被還原的希夫堿會(huì)分解產(chǎn)生戊二醛,可以用本方法測(cè)定解離下來(lái)的戊二醛。本方法應(yīng)用于終產(chǎn)品中殘余戊二醛的測(cè)定,戊二醛濃度低于檢出限
建立了一種測(cè)定血紅蛋白氧載體中戊二醛殘余含量的高效液相色譜方法。用10kDa超濾膜通過(guò)離心3000r/min×20min將游離戊二醛從待測(cè)樣品中分離;在pH1.0時(shí),在含有70%乙腈的體系中用2,4?二硝基苯肼在30min內(nèi)將戊二醛衍生成2,4?二硝基苯腙(n(2,4?二硝基苯肼)∶n(戊二醛)=60∶1),以70%乙腈為流動(dòng)相,避免了衍生產(chǎn)物生成沉淀。用高效液相色譜法分離測(cè)定衍生物,可在20min內(nèi)完成分離,同時(shí)對(duì)衍生步驟進(jìn)行了優(yōu)化。本方法具有較高的靈敏度和良好的線性關(guān)系,檢出限為1.0ng,在0.1~10mg/L范圍內(nèi)其線性相關(guān)系數(shù)為0.9999,重復(fù)測(cè)定6次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%,回收率為95.26%。
【關(guān)鍵詞】戊二醛,高效液相色譜,血紅蛋白氧載體,2,4?二硝基苯肼
1引言
血紅蛋白氧載體(Hemoglobin?basedoxygencarriers,HBOCs)是血液替代品中熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一[1,2]。其常用的一種制備方法是以多醛基分子為交聯(lián)劑,如戊二醛,開(kāi)環(huán)棉籽糖等將血紅蛋白交聯(lián)制備而成[3,4]。游離的戊二醛有一定的毒性,在臨床使用前必須除去。
檢測(cè)醛類(lèi)氣相色譜[5~7]具有較高的分析速度,但是靈敏度相對(duì)較低[8]。高效液相色譜被廣泛應(yīng)用于醛的測(cè)定[9~11],在測(cè)定戊二醛時(shí),顯示出更高的靈敏度[8]。
在液相色譜法中,2,4?二硝基苯肼(2,4?dinitrophenylhydrazine,DNPH)柱前衍生法是測(cè)定醛基的強(qiáng)有力的工具之一。文獻(xiàn)報(bào)道大多是測(cè)定空氣中戊二醛的污染,未見(jiàn)測(cè)定血紅蛋白氧載體中戊二醛的報(bào)道?!吨袊?guó)生物制品規(guī)程》中測(cè)定無(wú)細(xì)胞百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗中戊二醛的方法[12]不能直接用于血紅蛋白氧載體中戊二醛的測(cè)定,需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)處理,且線性關(guān)系較差。因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定血紅蛋白氧載體中殘留戊二醛的方法進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
2實(shí)驗(yàn)部分
2.1儀器與試劑
高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司),包括SCL?10Avp控制器,SPD?10Avp檢測(cè)器,LC?10Atvp雙泵,DGU?10A脫氣系統(tǒng),CTO?10Asvp柱溫箱,Class?vp工作站;CBN8?30恒溫水浴(丹麥Heto公司)。5804R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司),10kDa超濾膜(美國(guó)Millipore公司),SigoTCI?Ⅱ恒流泵(北京思路高公司),KL?UP?Ⅱ20超純水機(jī)(臺(tái)灣艾柯公司)。2,4?二硝基苯肼(98%)、HClO4、25%戊二醛(w/w)購(gòu)自Sigma公司,乙腈(色譜純,F(xiàn)isher公司)。
2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱(chēng)取2.3760gDNPH,用20%HClO4溶解并定容至100mL,配制成濃度為120mmol/L的貯備液,用20%HClO4稀釋至30mmol/L作為工作液。
2.2.2無(wú)基質(zhì)血紅蛋白(Stroma?freehemoglobin,SFH)的制備SFH的制備程序參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]的方法。
2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線將戊二醛分別稀釋成0.1,0.5,1,2,4,6,8和10mg/L,分別取0.5mL于5mL離心管中,加入1.4mL乙腈,再加入0.1mL120mmol/LDNPH,立即于混旋器上混合均勻,反應(yīng)30min后,用有機(jī)濾膜過(guò)濾后,上樣20μL進(jìn)行分析。
2.2.4血紅蛋白的聚合過(guò)程中戊二醛的測(cè)定血紅蛋白的聚合參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行,取80g/LSFH50mL,用恒流泵逐滴加入適量的戊二醛(n(SFH)∶n(戊二醛)=1∶10),待滴加完畢,聚合反應(yīng)4h后,加入1.0mol/L甘氨酸(終濃度0.1mmol/L)進(jìn)行終止,1h后,加入還原劑二甲胺基硼烷(DMAB)進(jìn)行還原(n(戊二醛)∶n(DMAB)=1∶6),反應(yīng)1h后,用Ringer′s液作為透析液透析24h,每6h換液一次,共換液4次。4℃保存15d,各取5.0mL加入到2個(gè)超濾膜(10kDa,Millipore)中[15],在4℃以3000r/min離心20min,取下層液體0.5mL,按2.2.3步驟進(jìn)行衍生并測(cè)定。
2.3色譜條件
Shim?packVP?ODS色譜柱(250mm×4.6mmi.d.,5μm,孔徑12nm,日本Shimadzu公司);流動(dòng)相:70%乙腈,流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):360nm。
3結(jié)果與討論
3.1目標(biāo)產(chǎn)物的確定
戊二醛有2個(gè)醛基,與DNPH反應(yīng)后生成的DNPH?one有3種可能的異構(gòu)體:順?順、順?反、反?反異構(gòu)體。圖1為標(biāo)準(zhǔn)戊二醛衍生后的色譜圖。圖1在乙腈體系中衍生的2,4?二硝基苯腙的色譜圖
Fig.1Chromatogramof2,4?dinitrophenylhydrazine(DNPH)?ones.Themobilephaseis70%acetonitrile
峰(peak)1.過(guò)量的DNPH(ExcessDNPHreagent);峰(peak)2,3.DNPH?ones異構(gòu)體(DNPH?oneisomer).有2個(gè)明顯的目標(biāo)峰(峰2與3),應(yīng)該為DNPH?one的其中兩種異構(gòu)體,具體為哪一種異構(gòu)體還有待于進(jìn)一步鑒定,第3種異構(gòu)體沒(méi)有觀測(cè)到的原因可能是由于異構(gòu)體之間結(jié)構(gòu)非常相似,第3種異構(gòu)體保留時(shí)間和另外兩種異構(gòu)體的其中一種相同,也可能是第3種異構(gòu)體的含量特別少,很難觀測(cè)到。在一定范圍內(nèi)用不同濃度的反應(yīng)物進(jìn)行分析,該峰2和峰3的峰面積都和戊二醛濃度之間有良好的線性關(guān)系,都可用于定量研究。分析化學(xué)第37卷第10期嚴(yán)坤平等:高效液相色譜法測(cè)定血紅蛋白氧載體中殘留的戊二醛
3.2色譜條件的優(yōu)化
在酸性情況下,用過(guò)量的DNPH充分和醛基反應(yīng),此反應(yīng)的產(chǎn)物2,4?二硝基苯腙在水中的溶解度較小,而在乙腈中的溶解度較大,圖2在50%乙腈體系中進(jìn)行衍生的2,4?二硝基苯腙樣品過(guò)濾前(a)后(b)色譜圖對(duì)比
色譜條件和圖1相同(OtherconditionsarethesameasdescribedinFig.1).峰(peak)1.過(guò)量的DNPH(ExcessDNPHreagent);峰(peak)2,3.DNPH?ones異構(gòu)體(DNPH?oneisomer)。直接在水中反應(yīng)或在乙腈比例較小時(shí)會(huì)使生成的產(chǎn)物產(chǎn)生沉淀。將6.0mg/L戊二醛在50%乙腈水溶液中衍生,產(chǎn)物用70%乙腈進(jìn)行分離,如圖2a所示,可以看出2,4?二硝基苯腙的色譜峰有明顯的拖尾,而將產(chǎn)物過(guò)濾后上樣(圖2b),則色譜峰無(wú)拖尾現(xiàn)象,這說(shuō)明拖尾是由于沉淀在吸附在色譜柱上,隨流動(dòng)相中重新溶解后再被洗脫下來(lái)的緣故。而若將6.0mg/L戊二醛在70%乙腈水溶液中衍生,產(chǎn)物仍用70%乙腈進(jìn)行分離,結(jié)果發(fā)現(xiàn),產(chǎn)物過(guò)濾和不過(guò)濾譜圖結(jié)果完全相同,都無(wú)拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)證實(shí),戊二醛濃度達(dá)到10.0mg/L時(shí),在70%乙腈水溶液中衍生不會(huì)產(chǎn)生沉淀。本實(shí)驗(yàn)室采用文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定血紅蛋白氧載體中的戊二醛時(shí),發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系較差,這就是由于采用的乙腈濃度太低,在衍生較高濃度的戊二醛(>6.0mg/L)時(shí)就會(huì)有沉淀產(chǎn)生,沉淀被過(guò)濾后導(dǎo)致定量分析不準(zhǔn)確。因此,衍生反應(yīng)應(yīng)該在乙腈比例較高的溶液中進(jìn)行,而且盡可能和流動(dòng)相比較接近,在70%乙腈溶液中進(jìn)行衍生可滿足10.0mg/L以下戊二醛的衍生。流動(dòng)相中乙腈的比例越大,衍生物洗脫時(shí)間就越短,峰形更為尖銳,相應(yīng)的靈敏度也越高,但是,洗脫時(shí)間太短,過(guò)量DNPH及雜質(zhì)的洗脫峰會(huì)干擾衍生物的洗脫峰,綜合考慮,以70%乙腈溶液為流動(dòng)相較好。
3.3衍生條件的優(yōu)化
在優(yōu)化衍生條件的實(shí)驗(yàn)中,全部采用1.0mg/L戊二醛為分析物濃度,峰面積以最靈敏的峰3計(jì)算。
3.3.1DNPH和戊二醛的摩爾比DNPH和戊二醛反應(yīng)生成希夫堿,該反應(yīng)不能進(jìn)行完全,因此通常采用過(guò)量的DNPH對(duì)戊二醛進(jìn)行衍生,盡可能將戊二醛定量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的腙。本實(shí)驗(yàn)在n(DNPH)∶n(戊二醛)為2∶1~120∶1的范圍內(nèi)研究了戊二醛的衍生反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明,在70%乙腈,pH=1.0,在20℃反應(yīng)30min的條件下,隨著DNPH濃度的增大,衍生物的轉(zhuǎn)化率也逐漸增大,當(dāng)n(DNPH)∶n(戊二醛)≥60∶1時(shí),轉(zhuǎn)化率基本保持不變,此條件可以作為定量分析的條件。本實(shí)驗(yàn)采用n(DNPH)∶n(戊二醛)=60∶1進(jìn)行衍生。
3.3.2pH值在乙腈中,HClO4比HCl的溶解性更好[16],因此,本實(shí)驗(yàn)采用HClO4調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的酸度。為了操作和計(jì)算方便,近似認(rèn)為[H ]≈[HClO4]。本實(shí)驗(yàn)在上述條件下改變pH值,研究了pH值對(duì)衍生反應(yīng)的影響。如圖3所示,pH1.0時(shí),戊二醛的衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高。
圖3pH對(duì)衍生效率的影響
Fig.3EffectsofpHofmediumonconversionefficiencyofglutaraldehydetoitsDNPH?onesn(DNPH)∶n(戊二醛,glutaraldehyde)=60∶13.2.3反應(yīng)溫度分別在0,10,20和30℃的條件下研究了溫度對(duì)衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化效率的影響,結(jié)果各溫度下衍生物的峰面積分別為166702,184363,187247,180590,除在0℃下面積略小外,其余溫度下的面積均非常接近,說(shuō)明在10~30℃的范圍內(nèi)反應(yīng)基本不受溫度影響。因此,本實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。
3.2.4反應(yīng)時(shí)間在80min內(nèi)研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化效率逐漸增大,在反應(yīng)20min后,衍生反應(yīng)達(dá)到平衡,衍生產(chǎn)物的濃度基本保持不變。為保證本方法的耐用性,衍生時(shí)間選擇30min。
3.3工作曲線、檢測(cè)限和精密度
戊二醛濃度在0.1~10mg/L范圍內(nèi)與單峰面積呈線性關(guān)系,其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=109306x-7405.1,相關(guān)系數(shù)(r)為0.9999,而如果采用文獻(xiàn)[12]的方法,r<0.99。逐級(jí)稀釋樣品,進(jìn)樣20μL,當(dāng)信噪比為3時(shí),戊二醛所對(duì)應(yīng)的濃度為0.05mg/L,即檢出限為1.0ng。以1.0mg/L戊二醛進(jìn)行衍生,平行6份,每份樣品各測(cè)定一次,每次進(jìn)樣20μL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.0%。
3.4標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率
采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定回收率。各取終產(chǎn)品5.0mL,分別加入到兩個(gè)10kDa的超濾膜中,在4℃以3000r/min離心10min,合并下層超濾液后取0.5mL,加入0.5μg(10μL0.05g/L)戊二醛,平行5份,按照2.2.3節(jié)進(jìn)行衍生。另取0.5mL超濾液按照2.2.3節(jié)直接進(jìn)行衍生,平行5份作為空白對(duì)照,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入實(shí)驗(yàn),計(jì)算得平均回收率為95.3%。
戊二醛作為交聯(lián)劑直接加入終產(chǎn)品中再次會(huì)引起聚合反應(yīng),所以上述測(cè)定回收率的方法是在超濾液中加入戊二醛進(jìn)行測(cè)定,為考慮超濾膜是否對(duì)戊二醛產(chǎn)生吸附,進(jìn)行了下述兩個(gè)實(shí)驗(yàn),取0.10mg/L戊二醛,(1)同樣品處理方法進(jìn)行處理,然后進(jìn)行色譜分析;(2)直接進(jìn)行衍生后進(jìn)行色譜分析;兩個(gè)實(shí)驗(yàn)各平行10份,對(duì)兩者峰面積平均值在顯著性水平為0.05的情況下進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),結(jié)果兩者無(wú)顯著性差異,說(shuō)明超濾膜對(duì)戊二醛基本無(wú)吸附,不會(huì)對(duì)回收率造成影響。
3.5終產(chǎn)品中戊二醛的測(cè)定
戊二醛和血紅蛋白的胺基反應(yīng)后生成希夫堿結(jié)構(gòu),希夫堿經(jīng)過(guò)還原后,生成穩(wěn)定的CN單鍵,但是,希夫堿是否能被100%還原還不清楚,如果沒(méi)有完全還原,由于生成希夫堿是可逆反應(yīng),在一段時(shí)間后,沒(méi)有被還原的希夫堿會(huì)分解產(chǎn)生戊二醛,可以用本方法測(cè)定解離下來(lái)的戊二醛。本方法應(yīng)用于終產(chǎn)品中殘余戊二醛的測(cè)定,戊二醛濃度低于檢出限
(來(lái)源:中國(guó)化工儀器網(wǎng))